很多小伙伴在選擇液相色譜柱時都會提到一個問題：“這根色譜柱能上多大的樣品量？”誠然，小伙伴們在做分析方法開發(fā)時都會竭力避免色譜柱過載。因為柱子的過載會造成色譜峰峰形失真，以及理論塔板數(shù)過低的問題。

特別是小伙伴做有關(guān)物質(zhì)方法開發(fā)中，經(jīng)常會遇到一組分析物中同時包含了較高濃度的主成分（也就是藥物活性成分）和很低濃度的雜質(zhì)（包括工藝雜質(zhì)及降解雜質(zhì)）。而為了兼顧低濃度雜質(zhì)的靈敏度，必然要增大進(jìn)樣體積，或者提高進(jìn)樣濃度，確保定量的準(zhǔn)確性。因此，某些時候就會造成色譜柱的過載。

色譜柱的過載又可以分為質(zhì)量過載和體積過載，這里小編就和各位小伙伴聊聊過載的那些事。

質(zhì)量過載

質(zhì)量過載又稱為濃度過載，就是指在小體積進(jìn)樣時（體積未過載），由于進(jìn)樣濃度較高，靠近譜峰峰帶的固定相被飽和，也就是說，進(jìn)樣某一組分超過了色譜柱的載樣量而出現(xiàn)過載的現(xiàn)象。一般表現(xiàn)為色譜峰峰形拖尾，柱效較低。

在小體積進(jìn)樣時，如果質(zhì)量未超載，隨著樣品量的增加（a<b<c），譜峰面積相應(yīng)增加（Aa<Ab<Ac），但是峰寬并沒有隨之增加。譜峰也顯正常。

圖1

隨著樣品量繼續(xù)增加，進(jìn)到色譜柱中的樣品達(dá)到飽和，譜峰就變形了。

圖2

從圖2可以看出，隨著進(jìn)樣質(zhì)量不斷增加，譜峰峰寬不斷增加，z終變成了直角三角形的形狀，同時譜峰的理論塔板數(shù)也不斷降低。通常，對于內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，其載樣量<50μg。如果是做方法轉(zhuǎn)移到其他色譜柱上，則需要調(diào)整進(jìn)樣量，防止出現(xiàn)過載。

載樣量主要與色譜柱固定相和待分析物的性質(zhì)有關(guān)。首先固定相類型不一樣，品牌不一樣會造成載樣量較大的差異。其次待分析物質(zhì)性質(zhì)也會直接影響到色譜柱載樣量。例如離子態(tài)的堿性化合物就很容易過載，不僅無法達(dá)到<50μg的量級，有時候甚至1μg的量就能造成過載的現(xiàn)象。因此在常規(guī)疏水反相中，分子態(tài)的堿性化合物比離子態(tài)的堿性化合物有著更高的載樣量。目前的推測原因是，離子態(tài)間互相排斥作用使得待分析組分在固定相表面更易達(dá)到飽和而造成過載。同時離子態(tài)的帶正電的堿性化合物也更容易和固定相中未鍵合的活性硅羥基發(fā)生次級相互作用。針對質(zhì)量超載的問題，Z簡單的方法則是減少進(jìn)樣量。

另外，混合樣品進(jìn)樣中過載還會導(dǎo)致峰保留時間的變化。

圖3

 例如圖3中，A’，B’為AB組分單獨進(jìn)樣時的保留分離情況。A，B為混合進(jìn)樣時的保留分離情況。過載的B不管是單獨進(jìn)樣還是混合進(jìn)樣，均保持穩(wěn)定，而A由于過量B的存在，在混合進(jìn)樣時，保留時間提前。

雖然每個成分的過載是相對獨立的，但是在混合樣品進(jìn)樣過程中會引起的分離度問題。這是由于環(huán)境對組分的影響。其中某一組分過載很可能造成混合進(jìn)樣時保留時間相對于單獨進(jìn)樣時有所改變。

體積過載

進(jìn)樣體積太大通常會導(dǎo)致較寬的平頭峰。

圖4

從圖4可以看出，隨著進(jìn)樣體積的增大，峰寬逐漸變寬，峰分離度降低。

另外體積過載還會影響峰保留時間，體積過載對保留時間短的組分影響更大，而對于較后面流出的峰影響較小。

圖5中虛線為正常體積進(jìn)樣，實線色譜圖為體積過載后的色譜圖。

那么，如何選擇合適的進(jìn)樣體積呢？

對于在z佳流速下 ，允許樣品進(jìn)樣的z大體積為：

其中：L為柱長（mm），dc為內(nèi)徑（mm），dp為粒徑（μm）

如果小伙伴嫌棄公式太繁瑣，也沒有關(guān)系，貼心的小編已經(jīng)主動把我們常用的各規(guī)格色譜柱列出：

注：z大進(jìn)樣體積作了近似整數(shù)處理
盡管上表中各個數(shù)據(jù)是嚴(yán)格按照公式計算出來的，但是這個數(shù)據(jù)并不絕對。色譜是經(jīng)驗科學(xué)，較之其他學(xué)科需要更多的實踐。當(dāng)然，理論也為我們指引了方向，讓我們能少走彎路。

各位小伙伴想了解更多有關(guān)色譜柱的知識，請咨詢月旭當(dāng)?shù)劁N售人員。